Preparando Rojo Ponceau

Como sabéis (o espero que aprendáis), el rojo Ponceau es el reactivo más utilizado para la tinción reversible de las proteínas en una membrana, aunque tiene el inconveniente de que su sensibilidad es limitada. Se prepara así:

ROJO PONCEAU

Ponceau  0.01%

Acido acético  0.1%

Disolver 0.5 g de Ponceau S en 1 ml de ácido acético glacial. Llevar hasta 100 ml con H₂O.

Preparando disoluciones de cloruro sódico 3M y 5M

Así de fácil:

NaCl  3M

8.767 g/50 ml

NaCl  5M

14.61 g/50 ml     

Recordad que no es para cocinar, así que autoclavar para disolver bien la sal.

EDTA 0.5 M pH=8.0

EDTA  0.5 M  pH=8.0  (ETILEN DIAMINO TETRAACÉTICO)

19.01 g/100 ml

Ajustar el pH con ácido acético.

Preparando denhardt 50x y 100x

DENHARDT 50X

Ficoll 400    -----------------------------    5 g

Polivinilpirrolidona   -------------------    5 g

BSA   ------------------------------------    5 g

H₂O  cantidad suficiente para  -------   500 ml

Filtrar para esterilizar y guardar a -20ºC en alicuotas de 25 ml.

 

DENHARDT 100X

Ficoll 400 ----------------------------- 10 g

Polivinilpirrolidona ------------------- 10 g

BSA ------------------------------------ 10 g

H₂O cantidad suficiente para ------- 500 ml

Filtrar para esterilizar y guardar a -20ºCen alicuotas de 25 ml

Preparando citrato fosfato pH=5

CITRATO FOSFATO  pH=5

A:   Acido cítrico  0.1 M   (4.2 g/200 ml)

B:   Na₂HPO₄  0.20 M  (14.3g/200 ml)

24.3 ml de A + 25.70 ml de B + 50 ml H₂O

Preparando blotto

Algo sencillo esta vez: los mil y un usos dela leche desnatada:

BLOTTO

5% leche desnatada disuelta en PBS-Tween 20.

Gel de secuenciación

GEL DE SECUENCIACIÓN

                                                 500  ml

Urea     ------------------------     225 g

Acrilamida     -----------------      28.75  g

Bisacrilamida      -------------        1.25 g

TBE (10X)     -----------------     50 ml

Agua cantidad suficiente para 500 ml.

 

Persulfato amónico al 10% y al 25%

PSA 10%  (persulfato amónico)

Persulfato amónico     ------------------------     10 g

H₂O cantidad suficiente para    -------------    100 ml

 

 

 

 

 

PSA 25% (persulfato amónico)

Persulfato amónico ------------------------ 25 g

H₂O cantidad suficiente para ------------- 100 ml.

Carbonato buffer pH=9.6

CARBONATO BUFFER  pH=9.6

                                                     1 litro

Na₂CO₃  Anhidro     ------------    1.59 g

NaHCO₃     ----------------------    2.93 g

H₂O destilada  cantidad suficiente para 1000 ml

Conservar a 4 ºC.

Disoluciones de bromuro de etidio

BROMURO DE ETIDIO

                                                     20 ml               100 ml

Bromuro de etidio     -----------    0.2 g   ---------   1 g

H₂O     ----------------------------   20 ml   --------   100 ml

 

Conservación de cepas

Los tres objetivos que hay que alcanzar para conservar correctamente las cepas microbianas en los laboratorios de microbiología son los siguientes:

- que el cultivo a conservar sea puro, evitando que se produzcan contaminaciones durante el proceso de conservación
- que durante el tiempo de conservación sobrevivan al menos el 70-80% de las células
- que estas células permanezcan genéticamente estables.

Los dos primeros objetivos no son muy difíciles de conseguir cuando se conoce bien la técnica microbiológica, pero el tercero puede presentar dificultades. Éste es el motivo por el cual existen varios métodos de conservación para los microorganismos, y ninguno de ellos es de utilización general.

Hoy vamos a ver, en lo referente a uno de ellos, cómo elaborar un material para la conservación de las cepas:

CONSERVACIÓN DE CEPAS    

1000 ml de cultivo

200  ml de glicerol 80%.

Preparando fenol

FENOL

– Fundir el fenol a 68-70 ºC

– Añadir 0.1 % de 8-hidroxiquinolina (esta actua como antioxidante, inhibe a la RNasa y además quela iones metalicos)

– Extraer varias veces (3 a 4) con igual volumen de Tris/HCL 1 M pH=8, aproximadamente hasta que la fase acuosa esté a 7-7.5 de pH

– Eliminar la última extracción (bomba de vacio)

– Añadir Tris/HCL 100 mM pH=8

O se puede hacer ya en el tubo una extracción con 100 mM Tris/HCl pH=8 y luego mantener a 4ºC con 10 mM Tris/HCL pH=8.

 

 

Preparando Azul de Coomassie

AZUL DE COOMASSIE

45% Metanol                                                 

10% Ácido acético                                             

0.25 % Azul brillante                                   

45% H₂O                    

Preparando Ampicilina

AMPICILINA

50 mg/ml  en agua

Refrigerar a  -20 ºC

Y no olvides esterilizar por filtración directamente a los Eppendorf

 

 

Preparando Acrilamida

ACRILAMIDA

Bastante sencillo:

 

30% acrilamida

0.8% Bis-acrilamida       

 

Disolución de acetato sódico 3 M

ACETATO SÓDICO 3 M

Acetato sódico · 3H₂O     -----------    408 g

H₂O     ---------------------------------    800 ml

Añadir H₂O hasta 1 l y ajustar el pH a 4.8 ó 5.2.

Disolución de acetato sódico 2.5 M pH= 5.2

ACETATO SÓDICO  2.5 M  pH= 5.2

17.01 g/50 ml

Ajustar el pH con ácido acético.

Y recuerda observar las mismas normas que las indicadas en el post número dos de este blog.

Disolución de acetato potásico 5 M pH=4.8

ACETATO POTÁSICO  5 M  pH=4.8

3 M para K⁺ y 5 M para Ac^–

PM (KAc) = 98.15 g/mol

K⁺Ac^–  5 M Þ 49.07 g/100 ml

                                                           100 ml

K⁺Ac^–  5 M     -----------------------     60 ml

Acido acético     ---------------------    11.5 ml

H₂O     ---------------------------------   28.5 ml

Se prepara y se deja así, no se ajusta el pH.

Recuerda observar las mismas normas que las indicadas en el post número dos de este blog.

Disolución de acetato amónico 10 M

Si tu laboratorio no tiene disoluciones preparadas o no te fías de ellas, prepáralas tú mismo. En los próximos post te indicaré las cantidades para hacerlo.

Te pondré una por post para que te sea más cómodo encontrarlas en el blog. Aquí va la primera:

 

ACETATO AMÓNICO  10 M

Acetato amónico     -----------   385.4 g     

H₂O     -------------------------   150 ml        

Añadir agua hasta 500 ml.

No olvides utilizar agua destilada, enrasar bien y recordar todas las normas de seguridad, prevención de riesgos laborales, limpieza, etc., etc. Te aconsejo que no muevas un dedo sin saber muy bien de antemano con qué productos tratas y vas a tratar a lo largo de todo el proceso.

Utiliza buen material de laboratorio en lo posible, y deja todo limpio y ordenado al terminar.

Primer post: de qué va este blog

Como habréis leido en la presentación, este es un blog práctico destinado a quienes se inician en la investigación de laboratorio que acepta -y agradece- aclaraciones, ampliaciones y correcciones, si fuera necesario -que probablemente lo será, porque no hay nadie perfecto-.

Con él pretendo evitarles a otros el suplicio de entrar en un laboratorio y descubrir que carecen de ciertos conocimientos básicos que se supone que deberían tener pero que, por la razón que sea, no poseen. Esto pasa con más frecuencia de lo que uno cree, y por si esto ya no fuera por sí solo desgracia suficiente, a veces el famoso libro con protocolos de investigación y o de preparación de disoluciones no existe o está en manos de alguien que no lo suelta ni por un millón de dólares, o al menos, no para que tú lo consultes,

Espero que este blog te sirva de ayuda en ausencia de citado libro y te deseo toda la suerte del mundo en tu recién iniciada profesión. Un saludo.